DeterminingAmino Acids (Serine and Glycine) HPLC Utilising a Fluorescence Detection by forming Isoindole Derivative

درسنا العوامل المؤثرة في تفاعل الاشتقاق لسيرين (Ser) و غلايسين (Gly) بمزيج من كاشفي الاشتقاق أورتوفتال ألدهيد (OPA) و 3 مركبتو بروبيونيك أسيد (3-MPA) لتشكيل مشتقات ايزندولية،حددنا الزمن اللازم و الأمثل لتفاعل الاشتقاق و هو خمس دقائق، يتم التفاعل في وسط من واقي البورات (pH=10,0.4M)، بنسبة ارتباط 3-MPA:OPA توافق 1:3 و نسبة ارتباط OPA:Amino acid توافق 1:2،حددنا الزمن الأمثل لقياس المركب المشتق من 0.1-20 min. و بعد دراسة كافة هذه العوامل قمنا بتحديد المشتق الايزندولي للسيرين و المشتق الإيزندولي للغلايسين بالتحليل بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء بالاعتماد على كاشف الفلورة من أجل التحديد الكمي لـــ Ser, Gly، باستخدام العمود Agilent Zorbax Exclipe RP C18، و قياس الفلورة عندλEx= 340 nm)، (λEm= 450 nm. حصلنا على مجال قياس خطي µM- 250.5 من أجل Ser، 1 - 25 µM من أجل Gly ، و حساسية و دقة عاليتين، و يتبين ذلك من القيمة المنخفضة للانحراف المعياري النسبي المئوي RSD% الذي لم يتجاوز قيمته لأصغر تركيز محدد ( 3.25% بالنسبة لــ Ser و 3.07% بالنسبة لــ Gly) ، و بنتائج صحيحة و دقيقة من خلال المردود النسبي المئوي% (103.0-102.0) بالنسبة لــ Ser و %(95.8-94.0) بالنسبة لــ Gly. بلغ حد الكشف للسيرين nM36.82 و حد التحديد الكمي nM111.59 و حد الكشف للغلايسين 22.12 nM و حد التحديد الكمي nM67.02.

We studied the Necessary Factors effecton Derivatization reaction forSerine and Glycine, The method involves the derivatization of Serine andGlycinewith a mixture of O-Phthaldialdehyde/3-Mercaptopropionic acid reagents to formisoindole derivative. The optimum time reaction was 5 min, in borate buffer (pH=10,0.4M), at molar ratio 3-MPA:OPA/1:3 and OPA:Amino acid/ 1:2, The optimum time for measurement was 0.1-20min. After the Derivatization step we determine isoindole derivatives with High Performance Liquid Chromatographyutilizing afluorescence (FL) detector for reliable quantitative determination of (Ser and Gly).The chromatographic separation was achieved on a reversed-phase Agilent Zorbax Exclipe RP18 (C18). The FL detector was set at excitation wavelength(λEx) of 340 nm and emission wavelength (λEm) of 450 nm. This method was validated with respect to linearity,0.5 – 25 μMfor Ser, and1 – 25 μMfor Gly, highly sensitivy, accuracy and precision with RSD% was not more than3.25 %, 3.07% for Ser and Gly respectively.And recovery% was (102.0-103.0)% for Ser, (94.0-95.8)% for Gly.The calculated detection limit was very low (36.82, 22.12) nMfor Ser and Gly, and with very low LOQ (111.59, 67.02)nMfor Ser and Glyrespectively.